تبیان، دستیار زندگی
روشی اختصاصی ، دقیق و کارآمد برای آشکار سازی (detection) رونوشت های (transcripts ) کمیاب و بررسی نمونه هایی با مقدار محدود، به حساب می آید. ...
عکس نویسنده
عکس نویسنده
بازدید :
زمان تقریبی مطالعه :

نسخه برداری معکوس- واکنش زنجیره ای پلیمراز (RT-PCR)

اهداف:

آشنایی با نسخه برداری معکوس- واکنش زنجیره ای پلیمراز (RT-PCR)

آشنایی با مواد و مراحل نسخه برداری معکوس

اساس روش RT-PCR

RT-PCR روشی اختصاصی، دقیق و کارآمد برای آشکار سازی (detection) رونوشت های (transcripts ) کمیاب و بررسی نمونه هایی با مقدار محدود، به حساب می آید.

به واسطه نقش کلاسیک مرحله RT در سنتز DNA ی مکمل یا همان (complementary DNA) تک رشته ای، این روش از روش های بررسی بیان ژن را به طور کلی RT-PCR می نامند. در مرحله اول روش RT- PCR از ملکول RNA ( رونوشت ژنی ) به عنوان الگو برای سنتز مولکول cDNA استفاده می شود، بدین منظور یک آنزیم نسخه بردار معکوس( Reverse Transcriptase ) ویروسی به همراه یک روش مناسب برای شروع واکنش پلی مریزاسیون مورد نیاز است. سپس در مرحله بعد با کمک PCR مولکول cDNA به طور لگاریتمی افزایش می یابد.  محصول PCR استفاده های گوناگونی می تواند داشته باشد.

به عنوان مثال از محصول PCR می توان در بررسی های کمی، کلون کردن و تعیین توالی استفاده کرد. همچنین از آن می توان به عنوان پروب prob و الگو template برای رونویسی در شرایط آزمایشگاهی in vitro بهره گرفت.

کل RNA ی سلول (total RNA ) یا RNA های دارای دم پلی آدنیلات( Poly-adenylate (polyA) tail ) می توانند به عنوان الگو در RT-PCR عمل کنند. cDNA می تواند از یک نمونه RNA ی کامل یا از یک ژن خاص تولید شود. برای تولید محصول فراوان، حساسیت بالا ضروری است. بدین معنی که روش مورد استفاده باید قادر باشد از نمونه های کم و ژن هایی با تعداد نسخه پایین ، cDNA ی کافی بسازد. پایداری دمایی (thermal stability) بالا برای فعالیت آنزیم نسخه بردار معکوس نیز دارای اهمیت است، چون در دماهای بالاتر، ساختارهای دوم RNA باز می شود و بازده تولید cDNA افزایش می یابد.

توضیح فیلم:

مواد اولیه مورد نیاز جهت انجام یک PCR شامل DNA الگو، DNA پلیمراز، پرایمرهای اولیگو نوکلئوتیدی، dNTPs، MgCl2 می باشند. پس از ساخته شدن cDNA ، می توان از آن برای بررسی های کمی، کلون کردن و تعیین توالی استفاده نمود.

به حداقل رساندن آلودگی ناشی از DNA

آلودگی ناشی از DNA ی ژنومی در RNA های جدا شده، مشکل نهفته ای است که RT-PCR با آن مواجه می باشد. وجود آلودگی ناشی از DNA به طور قابل توجهی به سنجش کمی نادرست منتهی می گردد. از این رو هر نوسانی در تعداد نسخه های mRNA در بین نمونه ها می تواند بازتابی از مقادیر متفاوت آلودگی DNA بین آنها باشد.

یک استخراج موفق RNA، مقدار آلودگی ناشی از DNA ی ژنومی را در فرآورده RNA به حداقل می رساند. برای جلوگیری از تولید محصول PCR از الگوی DNA ی ژنومی، فراورده RNA با آنزیم داکسی ریبونوکلئاز (DNase I (I تیمار می گردد. بدین ترتیب DNA ی آلوده کننده قبل از مرحله RT حذف می گردد. به منظور تشخیص cDNA ی آمپلی فای شده از DNAی ژنومی آمپلی فای شده (در صورت وجود آلودگی احتمالی ) در RT-PCR پرایمر ها را طوری طراحی می کنند که در اگزون های مجزا متصل شوند.

بدین ترتیب محصولات PCR حاصل از آمپلی فیکاسیون cDNA کوتاه تر از محصولات حاصل از آمپلی فیکاسیون DNA ی ژنومی خواهد بود. به علاوه با انجام یک آزمایش کنترلی بدون حضور آنزیم نسخه بردار معکوس برای هر الگوی RNA ، می توان مشخص کرد که آیا قطعه آمپلی فای شده از منشاء DNAی ژنومی است یا cDNA. محصولات تولید شده در غیاب RT از منشاء DNA ی ژنومی هستند. در حال حاضر پروتکل های موجود برای RT-PCR به دو صورت RT-PCR تک مرحله ای و RT-PCR دو مرحله ای هستند. از لحاظ انجام واکنش RT-PCR تک مرحله ای به طور قابل توجهی ساده تر از RT-PCR دو مرحله ای است اما مشکل اساسی این روش عدم امکان بررسی همزمان چندین ژن متفاوت می باشد.


مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا