آنزیم های نوکلئازی 1

اهداف:

• آشنایی با جداسازی ژن خاص
• آشنایی با خالص سازی آن ژن خاص

شرح درس:

با شناخت DNA به عنوان یکی از ماکرومولکول های اساسی، تجزیه و تحلیل آن بسیار ساده شده است. در حال حاضر یک دانشجوی مبتدی زیست شناسی نیز می تواند ناحیه خاصی از DNA را که حاوی ژن خاصی است را جدا کند و تعداد بی شمار و دقیقی از آن DNA را تولید کند و توالی نوکلئوتیدی آن را  تعیین نماید. امروزه توالی کامل نوکلئوتیدی ژنوم یک موجود یوکاریوتی و چند باکتری به خوبی شناخته شده است.

دانشمندان از همان زمانی که مشخص شد اطلاعات ژنتیکی توسط توالی نوکلئوتیدی DNA رمز گذاری می شوند، تمایل به بررسی مستقیم DNA و تعیین توالی نوکلئوتیدی آن داشته اند تا بتوانند به چگونگی کارکرد ژن ها در سطح مولکولی پی ببرند. پیشرفت های فراوانی در درک ساختار و تنظیم ژن از طریق روش های غیر مستقیم ژنتیکی در موجودات مانند باکتری اکی کولی و مگس دروزوفیلا روی داده است ولی ژنوم های بزرگ و پیچیده ی یوکاریوتی در حقیقت به مثابه قله ای فتح ناپذیر بوده است. ژن بر خلاف پروتئین در سلول ماهیت مجزایی ندارد بلکه بخشی از مولکول بزرگ DNA است.

اگرچه DNA را می توان با کمی تکان دادن به قطعات کوچکی شکست با این حال قطعه ای از آن که حاوی ژن خاصی است یکی از صدها هزار یا بیشتر قطعه DNA است که از ژنوم یک پستاندار به دست می آیند. از طرفی در نمونه ای که حاوی چند نسخه یکسان از یک مولکول بزرگ DNA می باشد هر مولکول در محل های متفاوتی شکسته می شود و در نتیجه مجموعه ایی گیج کننده از قطعات تصادفی به وجود می آورد.

راه های جداسازی یک ژن و خالص سازی آن چگونه است؟

یکی از راه حل های حل این مشکل زمانی کشف شد که دسته ای از آنزیم های باکتریایی به نام نوکلئازهای محدود کننده کشف شدند. نوکلئازها ،هیدرولیز پیوند فسفودی استر موجود در اسیدهای نوکلئیک را کاتالیز می کنند. اما این فقط خاصیت این آنزیم ها نیست و آن ها دارای خاصیتی هستند که با بقیه نوکلئازها متفاوت است. آن ها DNA را فقط در نقاط به خصوصی که توالی نوکلئوتیدی کوتاهی دارند می شکنند. بنابراین از آنزیم های محدود کننده می توان برای تولید مجموعه ایی از قطعات خاص DNA از ژنوم استفاده نمود.

این آنزیم ها همانند سایر ابزارهای فن آوری DNA، ابتدا توسط محققینی کشف شد که سرگرم مطالعه مساله ی زیست شناختی خاصی بودند که علاقه آن ها را به خود جلب کرده بود. آن ها دیده بودند که برخی از باکتری ها همیشه DNA سایر باکتری ها را که به صورت تجربی وارد آن ها می شوند، می شکنند. تحقیقات در مورد این نوع شکسته شدن آن ها را به کشف رده ای جدیدی از نوکلئازها موجود در باکتری میزبان شد.

مهم ترین خصیصه ی نوکلئازها این است که DNA را فقط در توالی های نوکلئوتیدی خاصی برش می دهند. DNA خود باکتری از طریق تغییراتی شیمیایی در همین توالی ها محافظت می گردد.  از آن جایی که این آنزیم ها انتقال DNA بین سویه های خاصی از باکتری را محدود می کنند از اصطلاح " نوکلئاز محدود کننده" برای نام گذاری آن ها استفاده می شود.

گونه های مختلف باکتریایی حاوی نوکلئازهای محدود کننده ی مختلفی هستند که هر کدام توالی نوکلئوتیدی خاص و متفاوتی را برش می دهند. نوکلئازهای محدود کننده ی مورد استفاده در فن آوری DNA نوترکیب عمدتاً منشا باکتریایی دارند و از آن جایی که توالی های هدف انها کوتاه هستند – بین 8-4 زوج نوکلئوتید- وجود این توالی ها در مولکول های طویل DNA کاملاً حالت شانسی دارد. بنابراین می توان از آن ها برای تجزیه و تحلیل DNA با هر منشای استفاده کرد.

امروزه نوکلئازهای محدود کننده ابزار بسیار مناسبی در فن آوری DNA هستند. توانایی نوکلئازهای محدود کننده در برش DNA در محل های خاص از اهمیت بسیار بالایی در تمامی جنبه های فن آوری مدرن DNA برخوردار است. دلیل مفید بودن آن ها این است که یک نوکلئاز محدود کننده ی خاص همیشه مولکول DNA خاصی را در نقاط ویژه ای برش می دهد. پس واکنش نمونه ای از DNA مثلاً DNA بافت انسانی با نوکلئاز محدود کننده ی خاصی همیشه منجر به تولید مجموعه یکسانی از قطعات DNA می شود. فراوانی توالی های هدف نوکلئازهای محدود کننده در مولکول DNA متفاوت است.

جهت دانلود فیلم آموزشی کلیک نمایید.

توضیح فیلم:

آنزیم های محدود کننده نوکلئازی می توانند DNA را براساس قسمت هایی که برای آن ساخته شده اند برش دهند.

مرکز یادگیری سایت تبیان - تهیه: فاضل صحرانشین سامانی

تنظیم: مریم فروزان کیا