جدا سازی و بررسی عملكرد باكتری های تجزیه كننده سلولز، جلسه دوم
آنزیم های سلولاز سلولز را در چندین مرحله تجزیه نموده كه در نهایت محصول نهایی تجزیه، گلوكز خواهد بود. در اینصورت گلوكز حاصل از تجزیه معیاری برای سنجش عملكرد آنزیم خواهد بود.در این قسمت سنجش گلوكز از دو روش كیفی ( معرف بندیكت (Benedict) ) و كمّی (دستگاه گلوكومتر (Glucometer)) شرح داده می شود. صد میلی لیتر محلول متیلسلولز 1/0 % آماده نمایید؛ 20 میلی لیتر از آن را به عنوان شاهد جدا كرده و به 80 میلی لیتر باقی مانده به كمك فیلدوپلاتین استریل شده باكتری های جدا شده از خاك اضافه نمایید؛ نمونه ها را به مدت 1 روز در دمای 30 درجه قرار دهید.
برای بررسی كیفی تولید گلوكز به حمام آب گرم و معرف بندیكت احتیاج دارید. 4 میلی لیتر از محلول متیل سلولز شاهد و محلول باكتری دار را در دو لوله آزمایش كه به ترتیب با عناوین شاهد و سلولاز برچسب گذاری شده اند، بریزید. 1 میلی لیتر معرف بندیكت به هر لوله اضافه نمایید. لوله ها را به مدت 5 دقیقه در حمام آب گرم قرار داده و تغییر رنگ احتمالی را در جدول زیر ثبت كنید.
جدول 1
نمونه شاهد سلولاز رنگ نمونه قبل از حرارت رنگ نمونه بعد از حرارت
در این قسمت میزان گلوكز محلول شاهد و محلول انكوبه شده را اندازه گیری نموده و در جدول یادداشت كنید. نحوه استفاده از این دستگاه ساده است. كافی است یك قطره كوچك از محلول را بر قسمت مشخص شده روی نوار قرار داده و از سمت درست، نوار را به دستگاه وارد كنید بعد از چند لحظه عدد نمایش داده شده میزان گلوكز بر واحد میلی گرم در هر دسی لیتر (100 میلیلیتر) است، برای تبدیل عدد به دست آمده به واحد گرم بر لیتر آن را بر عدد 100 تقسیم نمایید. قبل از استفاده از دستگاه مطمئن شوید نحوه كار با دستگاه را كاملاً می دانید، زیرا نوارهای دستگاه یكبار مصرف هستند. از آنجایی كه این دستگاه برای اندازه گیری قند خون ساخته شده است برای غلظت های خیلی پایین تر و یا بالاتر از محدوده غلظتی گلوكز در خون انسان، به ترتیب پیغامهای lowو High را نشان می دهد. در صورتی كه غلظت گلوكز محلول، بالاتر از حد تشخیص دستگاه است، آن را با ضریب مشخصی رقیق نمایید. بهتر است از ضریب 2/1 (یك حجم محلول و یك حجم آب) استفاده نمایید. برای تخمین درست ضریب رقت به نتیجه آزمایش كیفی مراجعه نمایید. در صورتی كه رنگ ایجاد شده به سمت آجری پررنگ است حتی می توانید از ضریب 10/1 برای رقیقسازی استفاده نمایید. شما باید دقت كنید كه نه خیلی زیاد رقیق كنید كه با پیغام حد پایین دستگاه مواجه شوید و نه خیلی كم رقیق كنید كه مجبور شوید چندین بار این كار را تكرار نمایید. در آخر با ضرب نمودن معكوس ضریب رقت در عدد به دست آمده، غلظت گلوكز در محلول حاوی باكتری را محاسبه كنید.
جدول 2
نمونه شاهد سلولاز ضریب رقت عدد نمایش داده شده غلظت گلوكز g/lit
نتایج
تغییر رنگ معرف بندیكت از آبی به یكی از رنگ های زیر نشان دهنده وجود گلوكز در محلول است. از آنجایی كه محلول اولیه فاقد گلوكز بوده است و معرف بندیكت در حضور سلولز تغییر رنگ نمی دهد؛ می توانید مطمئن باشید گلوكز موجود در محلول نتیجه فعالیت آنزیم های سلولاز باكتری است.
مقدار گلوكز تولیدی را نیز از نتیجه آزمایش كمی می توانید تخمین بزنید. عدد نشان داده شده برای نمونه شاهد Low است.
سؤالاتی كه بعد از انجام آزمایش می توانید به آنها پاسخ گویید:
1- نحوه كار دستگاه گلوكومتر برای اندازه گیری قند خون چگونه است؟
2- چگونه می توان مطمئن شد باكتری جدا شده، یكی از گونه های جنس سلوموناس است؟
3- دلیل استفاده از محیط كشت سلولزدار برای جداسازی باكتری های تجزیه كننده سلولز چیست؟
4- مقدار دقیق گلوكز موجود در 80 میلی لیتر محلول انكوبه شده را بر حسب گرم محاسبه كنید.
این پروژه را چگونه می توان ادامه داد:
1- خاك مناطق مختلف را برای جدا سازی باكتریهای تجزیه كنندهی سلولز مورد آزمایش قرار داده و بین نتیجه آنها و شكل خاك ارتباط برقرار نمایید.
2- آزمایشی طراحی كنید كه باكتری های تجزیه كنندهی سلولز را از میوه های در حال فساد جدا نمایید.
3- بخش اعظم كاغذ، دستمال كاغذی و محصولات مشابه از سلولز تشكیل شده است! بررسی نمایید آیا باكتری جدا شده توانایی تجزیه این مواد را دارد؟
4- مقداری پسماند سبزی تهیه كنید، آن را به دو قسمت مساوی تقسیم كرده و در دو ظرف مجزا بریزید. به یكی از ظرفها، مقداری محلول باكتری اضافه نمایید. درِ هر دو ظرف را ببندید و بعد از یك هفته تغییرات پسماند سبزی را در دو ظرف مقایسه نمایید.
5- كمترین زمان انكوباسیون برای تجزیه سلولز را پیدا كنید و نمودار تجزیه سلولز در طول زمان را به دست آورید.
آیندههای شغلی یك زیستشناس ـ متخصص میكروبیولوژیست در مركز تحقیق و توسعه شركت بازیافت
یكی از معضلات آدمی در دنیای صنعتی امروز مصرف گرایی است كه پیامدهای ناخوشایندی نظیر از بین رفتن منابع طبیعی، تولید زباله و آلودگی محیطزیست را به همراه دارد. متخصصین میكروبیولوژی با شناختی كه از میكروبهای مختلف و قابلیتهای آن ها در تجزیه مواد دارند، می توانند راه حل های كاربردی مهمی در راستای تجزیه زباله، مواد ارزشمند داشته باشند.
معمولاً فارغالتحصیلان رشته های میكروبیولوژی محیط، بیوتكنولوژی و بیوشیمی می توانند در این حرفه موفق باشند.
منابع:
1- بیوشیمی آزمایشگاهی – دكتر سید محمد حسین میر مؤمنی، دكتر سیروس قبادی- انتشارات دانشگاه رازی (1386)
2- بیوشیمی استرایر. انتشارات خانه زیستشناسی
3- Studies on cellulose degrading bacteria in tea garden soils; A. Balamurugan*, R. Jayanthi, P. Nepolean, R. Vidhya Pallavi and R. Premkumar; African Journal of Plant Science Vol. 5 (1), pp. 22-27,
مطالب مرتبط:
جدا سازی و بررسی عملكرد باكتری های تجزیه كننده سلولز، جلسه اول
جدا سازی و بررسی عملكرد باكتری های تجزیه كننده سلولز، جلسه دوم
بخش پژوهش های دانش آموزی تبیان، تهیه: زینب باقری
تنظیم: زینب شاه مرادی